细胞衰老检测方法与步骤

细胞衰老检测方法与步骤：
（1）、细胞接种前在6孔培养板中预先放置灭 菌的细胞片，每孔加入1×10E5个细胞，37℃ 5% CO2条件下培养过夜，使细胞在细胞片上生长。
（2）、在超净工作台中吸弃6孔培养板中的培养液，加入×1 PBS，洗涤细胞1次，随后加入2%甲醛/0.2%C5H8O2固定液，室温条件下固定3~5分钟。
（3）、吸弃2%甲醛/0.2%C5H8O2固定液，加入×1 PBS，洗涤细胞3次，每次3分钟。
（4）、吸弃×1 PBS，加X-Gal溶液以浸没细胞片为宜，37℃孵育4~8小时或过夜，用保鲜膜包被6孔培养板以防染液蒸发。
（5）、取出细胞爬片，去离子水冲洗2次，再次用固定液固定4分钟，流水轻轻冲洗。
（6）、将细胞爬片按此顺序脱水、透明∶95%酒精I（2分钟）→95%酒精Ⅱ（2分钟）→100%酒精I（2分钟）→100%酒精I（5分钟）→C₈H₁₀I（2分钟）→C₈H₁₀Ⅱ（2分钟）。
（7）、中性树胶封片。
（8）、在普通光学显微镜下观察衰老细胞形态。
每张片子镜下计数400个细胞，确定X-Gal染色阳性细胞（衰老细胞）在细胞群体中的所占的百分比即衰老细胞率（蓝染细胞数/总计细胞数×100%）。
细胞衰老检测注意事项：
（1）、X-Gal溶液需要现用现配。
（2）、细胞固定时间过长或固定之后清洗不干净，均会影响后续的酶反应。