PCR引物设计原则细节盘点:
1、.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的zui 适延伸温度会超过Taq酶的zui适温度，也影响反应的特异性。
2、.碱基分布：四种碱基ui好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
3、3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率zui低，G、C居中间，因此引物的3’端zui好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。
4、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。
5、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3’端不应超过2个。
6、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。
g.5’端无严格限制：5’末端碱基可以游离，但zui好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。
根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。