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氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离及纯化

氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化:



1.  NTA层析柱的准备:在层析柱中加入1 mL NTA介质,并分别用8 mL 去离子水,8 mL上样缓冲液洗涤。



2.  重组蛋白的变性裂解:在冰浴中冻融菌体沉淀,加入5 mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬,超声波破裂菌体,用振荡器等轻柔的混匀样品60 min,4℃ 12000 rpm 离心 30 min,将上清吸至一个干净的容器中,并弃沉淀。取10 ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。



3.  上清样品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。



4.  洗脱杂蛋白:用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱,直至OD280 = 0.01分步收集洗脱液,约3-4 h,取10 ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。



5.  洗脱目标蛋白:用Elution Buffer洗柱,收集每1 mL 级分,分别取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。

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